FISIOLOGÍA. Boletín de la SECF. Vol 5,nº1. Abril 2002

Actualización  

Nuestros conocimientos sobre la fisiología del endotelio vascular han aumentado de forma considerable desde el descubrimiento por Robert Furchgott, en 1980, de que el endotelio controla el tono del musculo liso vascular mediante la liberación de un factor relajador derivado del endotelio (EDRF) y el descubrimiento de Salvador Moncada, en 1987, de que este EDRF es concretamente el gas óxido nítrico (NO). En la siguiente revisión del Dr. Nava sobre endotelio vascular, óxido nítrico y presión arterial se hace un repaso de la biología del  NO en el endotelio vascular y la célula muscular lisa, y se destacan los hallazgos más recientes sobre la fisiología del endotelio vascular, como la fosforilación de las serinas o los hallazgos en ratones knock out para caveolina. Asimismo, se analiza el papel del NO en el control de la presión arterial a largo plazo y en la enfermedad hipertensiva, haciendo especial referencia a los últimos logros en terapia génica de la hipertensión actuando sobre el gen de la NO sintetasa.

 

ENDOTELIO VASCULAR, ÓXIDO NÍTRICO Y PRESIÓN ARTERIAL

Eduardo Nava Hernández 

Funciones del endotelio vascular

E

l endotelio vascular es un epitelio plano simple que tapiza la cara interna de los vasos sanguíneos y el corazón. Las células endoteliales tienen numerosas funciones en la homeostasis, entre las que destacan las siguientes:

1.      Forman una superficie lisa que facilita el flujo laminar de la sangre y previenen de la adherencia de las células sanguíneas.

2.      Forman una barrera de permeabilidad para el intercambio de nutrientes entre plasma e intersticio, regulando al mismo tiempo el transporte de sustancias entre ambos.

3.      Regulan la angiogénesis y el remodelado vascular.

4.      Contribuyen a la formación y mantenimiento de la matriz extracelular.

5.      Producen factores de crecimiento en respuesta al daño vascular, influyendo especialmente en la proliferación del músculo liso vascular.

6.      Producen sustancias que regulan la agregación plaquetaria, coagulación y fibrinolisis.

7.      Sintetizan y degradan diversas hormonas.

8.      Participan en la respuesta inmune generando citokinas que modulan la actividad de los linfocitos.

9.      Liberan agentes que actúan de forma paracrina sobre las células musculares lisas adyacentes, regulando su contracción.

            En esta revisión nos vamos a centrar en esta última función, y en particular la del óxido nítrico (NO) producido por el endotelio. El endotelio vascular produce y libera sustancias vasodilatadoras y vasoconstrictoras. Entre las vasodilatadoras figuran: el NO (antiguamente conocido como factor relajador derivado del endotelio o EDRF), factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) y prostaciclina. Entre las sustancias vasoconstrictoras figuran: las endotelinas y el tromboxano A2. 

El endotelio, fuente de NO

            El óxido nítrico (NO) se sintetiza a partir del aminoácido L-arginina (Fig. 1) (1) por una familia de enzimas llamadas NO sintasas (NOS) de la que se conocen tres isoformas. Una de estas isoformas es la NOS I, denominada también NOS neuronal o nNOS porque abunda  en tejido nervioso, aunque también está presente en otros tejidos como el riñón. Otra isoenzima es la NOS II o NOS inducible (iNOS), denominada así porque normalmente no está presente de forma constitutiva en las células, sino que su expresión se induce por un agente que activa el sistema inmune. De hecho, esta isoforma abunda en las células del sistema monocítico-macrofágico, aunque también se ha encontrado en otras células, como son las células musculares lisas vasculares. La última isoforma, NOS III es constitutiva de las células endoteliales vasculares, por lo que también se la conoce como eNOS. También está presente en otros tejidos como el miocardio. De las tres isoformas, nNOS y eNOS tienen papeles fisiológicos, mientras que iNOS aparece fundamentalmente en condiciones patológicas.

            Como se ha indicado, el endotelio vascular expresa constitutivamente eNOS o NOS III. Tradicionalmente esta enzima se consideraba calcio-dependiente ya que su actividad se inhibía en presencia de quelantes de calcio. De hecho, la vía más importante y conocida de activación, al menos por estimulación agonista-receptor, es por calcio-calmodulina (Fig. 1). La estimulación de la célula endotelial daría lugar a una activación de una proteína G y la subsiguiente puesta en marcha de la fosfolipasa C (PLC), ambas en la membrana plasmática. La PLC cataliza la formación de 1,4,5-inositoltrifosfato (IP3) que activa la apertura de los canales de calcio asociados al receptor IP3 del retículo endoplásmico. Finalmente el calcio libre en el citoplasma se une a la calmodulina y este complejo activa a eNOS, que cataliza la oxidación del terminal guanidino nitrógeno de la L-arginina para formar NO y L-citrulina. El NO es un gas liposoluble que difunde y atraviesa con facilidad las membranas celulares. Como además es un radical libre muy inestable que reacciona rápidamente con el oxígeno para formar nitrito, tiene una vida media muy corta, del orden de unos pocos segundos, lo que condiciona que su función como mediador de comunicación intercelular sea de tipo paracrino y autocrino. Como se detallará más adelante, las células diana del NO de origen endotelial son las células musculares lisas. 

Estimulación de la síntesis de NO endotelial 

            La liberación de NO aumenta en respuesta a dos tipos de estímulos: mecánicos y farmacológicos. La estimulación mecánica es la que tiene un papel fisiológico en el mantenimiento de un tono vascular vasodilatador permanente. Las células endoteliales son particularmente sensibles a la tracción de cizallamiento o shear stress que ejerce la sangre al fluir por los vasos sanguíneos (Fig. 1) (3). Esta fuerza es directamente proporcional al flujo sanguíneo y a la viscosidad de la sangre, e inversamente proporcional al diámetro del vaso. Otros estímulos mecánicos que activan la síntesis de NO son el flujo pulsátil, que produce una deformación rítmica y repetitiva de las células endoteliales, y la presión hidrostática. Un aspecto digno de mención respecto a la estimulación mecánica es que cuando ésta es prolongada puede dar lugar a la inducción de la eNOS, es decir, el aumento de la expresión proteica de este enzima. Este fenómeno se ha observado tanto con células en cultivo como en situaciones en las que el individuo se ve sometido a un aumento crónico de fuerzas endoteliales como el ejercicio físico (que aumenta el flujo sanguíneo) o la hipertensión, que implica un permanente estrés de la célula endotelial por un aumento de la presión hidrostática (2). Por esta razón se ha criticado la nomenclatura de las isoformas de la NOS, que asigna el nombre de “constitutiva” a isoformas que en realidad se pueden inducir. Al mismo tiempo, se sabe que la isoforma “inducible” se expresa constitutivamente en ciertos tejidos, como, por ejemplo, el riñón.

            La estimulación farmacológica también activa la síntesis de NO. Hay numerosos agonistas circulantes que actúan sobre receptores de la membrana endotelial. Entre ellos figuran la bradikinina, histamina, prostaglandinas, etc. Otros, como la acetilcolina, no son circulantes pero se utilizan a menudo en el laboratorio. Los receptores para estas sustancias activan la proteína G y la cascada del fosfoinositol-calcio que se mencionaron en el apartado anterior.

            Respecto a la transducción de la señal mecánica al interior de la célula endotelial, nuestro conocimiento tiene aún muchas lagunas. Se supone que la fuerza de cizallamiento de la membrana se transmite a través del citoesqueleto al interior de la célula y que esto condiciona una activación de las proteínas G. Sin embargo, cada vez se van descubriendo mecanismos alternativos de transducción de señal para la activación de eNOS que son independientes de calcio. Algunos investigadores consideran que la activación de eNOS por el flujo o el shear stress es completamente independiente del sistema calmodulina-calcio. De hecho, aunque es bien sabido que el shear stress da lugar a incrementos transitorios de calcio intracelular (3), la dinámica de estos incrementos es incompatible con la génesis continua de NO que produce dicho stress. Una de las rutas alternativas de activación de eNOS más importantes es la fosforilación de una serina de la eNOS por una proteína kinasa B (también conocida como Akt) (Fig. 1). Otras vías de activación incluyen la fosforilación de tirosina en la eNOS, el aumento del pH intracelular, y diversas proteínas de reciente descubrimiento (4). 

Localización intracelular de la eNOS 

            La eNOS está localizada en estructuras membranosas de la célula endotelial como el aparato de Golgi y la membrana plasmática. Las células endoteliales poseen pequeñas invaginaciones de la membrana, llamadas cavéolas, que son contiguas a la superficie de los túbulos sarcoplásmicos. Se piensa que las cavéolas son un análogo rudimentario del sistema de túbulos transversos del músculo esquelético. Estas cavéolas son dominios de la membrana plasmática enriquecidos en colesterol y glucoesfingolípidos, pero pobres en fosfolípidos, que funcionan como un lugar estratégico para el procesamiento de mensajeros y la transducción de señales en la célula endotelial (5). En particular, las cavéolas poseen grandes cantidades de proteínas G, receptores de IP3, de tirosina kinasa, etc. y además las cavéolas están enriquecidas en eNOS y calmodulina. eNOS permanece inactiva mientras está unida a una fosfoproteína de la cavéola, la caveolina. Cuando aumenta el calcio intracelular éste se fija a la calmodulina y el complejo calmodulina-calcio se une a eNOS, la desplaza de la caveolina y queda libre para sintetizar NO (5). La eNOS disociada de la caveolina, se transloca al citosol, es decir, deja de formar parte de la fracción membranosa de la célula para convertirse en una enzima citosólica. Cuando disminuye el calcio intracelular, eNOS vuelve a unirse a la caveolina de la membrana caveolar de forma que eNOS va moviéndose de la membrana al citosol, y viceversa, dependiendo de la presencia de calmodulina-calcio. Algunos autores han puesto en duda la importancia de la caveolina en la transducción de señales a la eNOS, especialmente los que defienden que ésta no necesita calcio para activarse (4). Sin embargo, se ha aportado una prueba definitiva de la importancia fisiológica de la caveolina en unos experimentos muy recientes realizados en ratones genéticamente carentes de cavéolas. Estos ratones presentan una actividad desmedida de la eNOS que se manifiesta por un incremento de la relajación endotelio-dependiente de vasos aislados, de la liberación basal de NO y del contenido de cGMP (6). 

Acciones del NO derivado del endotelio 

            El NO producido por la eNOS tiene, como ya se ha comentado, una acción autocrina y paracrina. Ambas se fundamentan en el mismo mecanismo: la unión del NO al grupo hemo de la guanilato ciclasa soluble ocasiona un cambio conformacional que incrementa su actividad (1). Esto condiciona una mayor producción de GMP cíclico (cGMP) a partir de GTP (Fig. 1). El cGMP activa a un enzima fosforilador de proteínas, la proteína kinasa G (PKG). Resultado de la actividad fosforiladora de esta kinasa son casi todos los efectos biológicos del NO. Las acciones autocrinas del NO en la célula endotelial han sido las menos estudiadas aunque se sabe que el cGMP disminuye la permeabilidad de la célula endotelial, así como la liberación del potente vasconstrictor endotelina-1. Las funciones paracrinas del NO se dan fundamentalmente en las células musculares lisas subyacentes. Las acciones de la PKG activada por cGMP en la célula muscular lisa van dirigidas a disminuir el calcio intracelular al objeto de producir relajación de la fibra. Recordemos que la fibra muscular lisa posee un aparato contráctil que depende de calcio para funcionar. En contraste con la célula muscular esquelética, que utiliza troponina como proteína ligadora de calcio, la célula muscular lisa usa calmodulina. El complejo calmodulina-calcio activa a la miosina kinasa, una enzima que fosforila a la cabeza de la miosina tras lo cual ésta se une a la actina y la desplaza causando la contracción (Fig. 1). Los puntos donde se conoce la actuación de la PKG sobre la dinámica del calcio aparecen en la Fig. 1 y son los siguientes:

1.      Activación de la ATPasa de calcio y el intercambiador calcio-sodio del retículo sarcoplásmico y de la membrana plasmática.

2.      Inhibición los canales de calcio tipo L.

3.      Inhibición de la PLC.

 

 

FIGURA 1. Vías de estimulación y síntesis de NO en la célula endotelial (arriba) y vías de acción de NO en la célula muscular lisa vascular. G = proteína G, PLC = fosfolipasa C, IP3 = inositol trifosfato, IP3R = receptor para IP3, REP = retículo endoplásmico, PKB = proteín kinasa B; L-arg = L-arginina, eNOS = oxido nítrico sistasa endotelial, Ca-calm = complejo calcio-calmodulina, L-cit = L-citrulina, sGC = guanilato ciclas soluble, PKG = proteína kinasa dependiente de cGMP, RSP = retículo sarcoplásmico, CaL= canal de calcio tipo L, KCa = canal de potasio calcio-dependiente.

            Otro mecanismo vasodilatador de la PKG, y también de forma directa del propio NO, es la activación de los canales de potasio dependientes de calcio (KCa). El aumento de permeabilidad de estos canales hiperpolariza la célula muscular lisa, lo cual disminuye el paso de calcio al citoplasma a través de los canales de calcio dependientes de voltaje. La disminución del calcio citosólico disponible relaja a la fibra muscular lisa. 

Papel del NO en el control de la presión sanguínea 

            El papel del NO en el control de la presión arterial no pudo establecerse hasta la aparición de análogos estructurales de L-arginina que pudieran ser utilizados in vivo para inhibir a la NOS. La administración de este tipo de inhibidores produce una hipertensión intensa y muy duradera. Esta observación permitió revisar un concepto muy establecido en fisiología, según el cual, el sistema cardiovascular está sometido a un continuo tono vasoconstrictor debido a la permanente descarga simpática del sistema nervioso. Ahora hay que añadir un segundo tono a los vasos, el tono vasodilatador generado por la permanente liberación basal de NO desde el endotelio. Los inhibidores de la síntesis de NO no son completamente específicos para ninguna isoforma de la NOS, y mucho menos los utilizados en los inicios de la investigación del NO. Por ello, la prueba irrefutable del papel del NO endotelial en el mantenimiento de la presión arterial ha sido el empleo de ratones manipulados genéticamente que carecen del gen que codifica para la eNOS. Los ratones homocigotos para la deleción del gen son hipertensos (Fig. 2b) (7) y presentan trastornos de la relajación endotelio-dependiente. Estos ratones, además, son incapaces de compensar las fluctuaciones ocasionales de la presión sanguínea dando lugar a trazados de presión errática (Fig. 2b), que recuerdan al trazado clásico de Guyton obtenido en perros a los se desaferentizaron los barorreceptores (Fig. 2a).   

FIGURA 2. a. Registro clásico de la presión arterial en un perro normal (arriba) y del mismo perro (abajo) varias semanas después de la denervación de los barorrectores. b. Variabilidad de la presión arterial en ratones normales (arriba) y ratones homocigotos para la deleción de eNOS (abajo). Véase como éstos además de una presión arterial muy variable, tienen hipertensión. La línea blanca es la presión arterial media. Modificado de la cita 7.

Papel del NO en la hipertensión arterial 

            Desde hace muchos años se sabe que la función endotelial está dañada en vasos obtenidos de animales hipertensos. Este daño se manifiesta en una mala relajación de vasos aislados en respuesta a vasodilatadores endotelio-dependientes. Cuando el papel del NO en el control de la presión arterial quedó establecido, esto dió lugar a numerosos estudios encaminados a dilucidar si la vía del NO está alterada en la hipertensión. Dado que los resultados de estos estudios no han sido unánimes, sino que varían dependiendo del modelo de hipertensión usado, vamos a resumir los hallazgos más recientes en este campo en los modelos más utilizados de hipertensión:

Hipertensión genética de la rata. Es quizá el modelo más utilizado, particularmente la rata espontáneamente hipertensa (SHR) obtenida tras la segregación y cría durante varias generaciones de ratas con presión anormalmente elevada. Con las ratas que presentan presión arterial normal se realiza la misma operación para obtener las ratas control (llamada Wistar-Kyoto). La respuesta vasodilatadora endotelio-dependiente de vasos de SHR es claramente defectuosa. Sin embargo, aunque pudiera parecer lo contrario, los estudios acerca de la biología del NO apuntan a que la actividad y la expresión de la NOS está aumentada en estructuras relacionadas con el control de la presión arterial (vasos, corazón y riñón) (2). Esta paradoja se explica porque, aunque la generación de NO está aumentada en la SHR, sus efectos fisiológicos están disminuidos por un exceso asociado de anión superóxido (8).  

Hipertensión sal-sensible. El modelo más utilizado es la rata Dahl, obtenida tras la segregación y cría durante varias generaciones de ratas con presión anormalmente elevada tras haber sido sometidas a una dieta alta en sodio (Dahl sal-sensible). Con las ratas que presentan presión arterial normal se realiza la misma operación y se obtienen ratas Dahl sal-resistente. En este modelo la generación de NO está claramente disminuida. Parece ser que el defecto está a nivel de la nNOS (no de la eNOS) de la médula renal, que como es sabido, tiene un papel fundamental en el manejo del sodio. 

Hipertensión renovascular. Se observa un cuadro parecido a la SHR. 

Hipertensión esencial humana. Casi todos los estudios tanto farmacológicos como analíticos indican un defecto de la síntesis de NO. Además, los pacientes normotensos con antecedentes familiares de hipertensión presentan también dicha alteración indicando que el trastorno no es una consecuencia de la hipertensión sino un fallo primario. La mayoría de los estudios se han llevado a cabo indirectamente utilizando la técnica de la medida del flujo sanguíneo antebraquial. Estudios más directos realizados en vasos sanguíneos obtenidos de biopsias de pacientes hipertensos indican una disminución de la relajación mediada por NO. En cuanto al análisis de la producción basal de NO es particularmente relevante un estudio realizado administrando a hipertensos voluntarios L-arginina marcada radiactivamente y midiendo posteriormente nitrato radiactivo en orina (9). Dado que no existe ninguna vía metabólica en células eucarióticas que genere nitrato, excepto la vía del NO, las dudas generadas por posible contaminación por nitratos de la dieta se obvian. Los niveles de nitrato radiactivo urinario son menores en pacientes hipertensos, lo que sugiere una menor producción global basal de NO en la hipertensión esencial humana. 

Terapia génica en hipertensión. 

     Se han obtenido resultados bastante espectaculares en ratas SHR y en ratas con hipertensión producida por angiotensina II a las que se les ha realizado una transferencia génica de eNOS humano (10). La transferencia se lleva a cabo utilizando como vector un plásmido de adenovirus o de citomegalovirus al que se le une el cDNA de eNOS humano. Los experimentos se suelen realizar incubando segmentos vasculares  de la rata hipertensa con el vector vírico, e incluso se ha expuesto el animal vivo al vector administrándolo por vía endovenosa. En estos experimentos se ha conseguido disminuir la presión arterial, aumentar la producción de metabolitos procedentes del NO, aumentar la expresión vascular de eNOS y  mejorar la función endotelial. 

Eduardo Nava Hernández

Facultad de Medicina, Universidad de Castilla-La Mancha

Edificio Benjamín Palencia, 02071 Albacete

Tels: 967 599200 Ext. 2745

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eduardo@med-ab.uclm.es

 

Bibliografía 

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8.       Zalba G, Beaumont FJ, San José G, Fortuño A, Fortuño MA, Díez J. Is the imbalance between nitric oxide and superoxide altered in spontaneously hypertensive rats? Nephrol Dial Transplan 2001; 16(S1): 2-5.

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10.   Alexander MY, Brosnan MJ, Hamilton  CA, Fennell JP, Deattie EC, Jardine E, Heistad DD, Dominiczak AF. Gene transfer of endothelial nitric oxide synthase but not Cu/Zn superoxide dismutase restores nitric oxide availability in the SHRSP. Cardiovasc Res 2000; 47:609-617.


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