FISIOLOGÍA. Boletn de la SECF. Vol 5,nº1. Abril 2002

Nuestros conocimientos sobre la fisiologa del endotelio vascular han aumentado de forma considerable desde el descubrimiento por Robert Furchgott, en 1980, de que el endotelio controla el tono del musculo liso vascular mediante la liberacin de un factor relajador derivado del endotelio (EDRF) y el descubrimiento de Salvador Moncada, en 1987, de que este EDRF es concretamente el gas xido ntrico (NO). En la siguiente revisin del Dr. Nava sobre endotelio vascular, xido ntrico y presin arterial se hace un repaso de la biologa del  NO en el endotelio vascular y la clula muscular lisa, y se destacan los hallazgos más recientes sobre la fisiologa del endotelio vascular, como la fosforilacin de las serinas o los hallazgos en ratones knock out para caveolina. Asimismo, se analiza el papel del NO en el control de la presin arterial a largo plazo y en la enfermedad hipertensiva, haciendo especial referencia a los últimos logros en terapia gnica de la hipertensin actuando sobre el gen de la NO sintetasa.

 

ENDOTELIO VASCULAR, XIDO NÍTRICO Y PRESIN ARTERIAL

Eduardo Nava Hernández 

Funciones del endotelio vascular

E

l endotelio vascular es un epitelio plano simple que tapiza la cara interna de los vasos sanguneos y el corazn. Las clulas endoteliales tienen numerosas funciones en la homeostasis, entre las que destacan las siguientes:

1.      Forman una superficie lisa que facilita el flujo laminar de la sangre y previenen de la adherencia de las clulas sanguneas.

2.      Forman una barrera de permeabilidad para el intercambio de nutrientes entre plasma e intersticio, regulando al mismo tiempo el transporte de sustancias entre ambos.

3.      Regulan la angiognesis y el remodelado vascular.

4.      Contribuyen a la formacin y mantenimiento de la matriz extracelular.

5.      Producen factores de crecimiento en respuesta al dao vascular, influyendo especialmente en la proliferacin del músculo liso vascular.

6.      Producen sustancias que regulan la agregacin plaquetaria, coagulacin y fibrinolisis.

7.      Sintetizan y degradan diversas hormonas.

8.      Participan en la respuesta inmune generando citokinas que modulan la actividad de los linfocitos.

9.      Liberan agentes que actúan de forma paracrina sobre las clulas musculares lisas adyacentes, regulando su contraccin.

            En esta revisin nos vamos a centrar en esta última funcin, y en particular la del xido ntrico (NO) producido por el endotelio. El endotelio vascular produce y libera sustancias vasodilatadoras y vasoconstrictoras. Entre las vasodilatadoras figuran: el NO (antiguamente conocido como factor relajador derivado del endotelio o EDRF), factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) y prostaciclina. Entre las sustancias vasoconstrictoras figuran: las endotelinas y el tromboxano A₂. 

El endotelio, fuente de NO

            El xido ntrico (NO) se sintetiza a partir del aminoácido L-arginina (Fig. 1) (1) por una familia de enzimas llamadas NO sintasas (NOS) de la que se conocen tres isoformas. Una de estas isoformas es la NOS I, denominada tambin NOS neuronal o nNOS porque abunda  en tejido nervioso, aunque tambin está presente en otros tejidos como el rin. Otra isoenzima es la NOS II o NOS inducible (iNOS), denominada as porque normalmente no está presente de forma constitutiva en las clulas, sino que su expresin se induce por un agente que activa el sistema inmune. De hecho, esta isoforma abunda en las clulas del sistema monoctico-macrofágico, aunque tambin se ha encontrado en otras clulas, como son las clulas musculares lisas vasculares. La última isoforma, NOS III es constitutiva de las clulas endoteliales vasculares, por lo que tambin se la conoce como eNOS. Tambin está presente en otros tejidos como el miocardio. De las tres isoformas, nNOS y eNOS tienen papeles fisiolgicos, mientras que iNOS aparece fundamentalmente en condiciones patolgicas.

            Como se ha indicado, el endotelio vascular expresa constitutivamente eNOS o NOS III. Tradicionalmente esta enzima se consideraba calcio-dependiente ya que su actividad se inhiba en presencia de quelantes de calcio. De hecho, la va más importante y conocida de activacin, al menos por estimulacin agonista-receptor, es por calcio-calmodulina (Fig. 1). La estimulacin de la clula endotelial dara lugar a una activacin de una protena G y la subsiguiente puesta en marcha de la fosfolipasa C (PLC), ambas en la membrana plasmática. La PLC cataliza la formacin de 1,4,5-inositoltrifosfato (IP3) que activa la apertura de los canales de calcio asociados al receptor IP3 del retculo endoplásmico. Finalmente el calcio libre en el citoplasma se une a la calmodulina y este complejo activa a eNOS, que cataliza la oxidacin del terminal guanidino nitrgeno de la L-arginina para formar NO y L-citrulina. El NO es un gas liposoluble que difunde y atraviesa con facilidad las membranas celulares. Como además es un radical libre muy inestable que reacciona rápidamente con el oxgeno para formar nitrito, tiene una vida media muy corta, del orden de unos pocos segundos, lo que condiciona que su funcin como mediador de comunicacin intercelular sea de tipo paracrino y autocrino. Como se detallará más adelante, las clulas diana del NO de origen endotelial son las clulas musculares lisas. 

Estimulacin de la sntesis de NO endotelial 

            La liberacin de NO aumenta en respuesta a dos tipos de estmulos: mecánicos y farmacolgicos. La estimulacin mecánica es la que tiene un papel fisiolgico en el mantenimiento de un tono vascular vasodilatador permanente. Las clulas endoteliales son particularmente sensibles a la traccin de cizallamiento o shear stress que ejerce la sangre al fluir por los vasos sanguneos (Fig. 1) (3). Esta fuerza es directamente proporcional al flujo sanguneo y a la viscosidad de la sangre, e inversamente proporcional al diámetro del vaso. Otros estmulos mecánicos que activan la sntesis de NO son el flujo pulsátil, que produce una deformacin rtmica y repetitiva de las clulas endoteliales, y la presin hidrostática. Un aspecto digno de mencin respecto a la estimulacin mecánica es que cuando sta es prolongada puede dar lugar a la induccin de la eNOS, es decir, el aumento de la expresin proteica de este enzima. Este fenmeno se ha observado tanto con clulas en cultivo como en situaciones en las que el individuo se ve sometido a un aumento crnico de fuerzas endoteliales como el ejercicio fsico (que aumenta el flujo sanguneo) o la hipertensin, que implica un permanente estrs de la clula endotelial por un aumento de la presin hidrostática (2). Por esta razn se ha criticado la nomenclatura de las isoformas de la NOS, que asigna el nombre de “constitutiva” a isoformas que en realidad se pueden inducir. Al mismo tiempo, se sabe que la isoforma “inducible” se expresa constitutivamente en ciertos tejidos, como, por ejemplo, el rin.

            La estimulacin farmacolgica tambin activa la sntesis de NO. Hay numerosos agonistas circulantes que actúan sobre receptores de la membrana endotelial. Entre ellos figuran la bradikinina, histamina, prostaglandinas, etc. Otros, como la acetilcolina, no son circulantes pero se utilizan a menudo en el laboratorio. Los receptores para estas sustancias activan la protena G y la cascada del fosfoinositol-calcio que se mencionaron en el apartado anterior.

            Respecto a la transduccin de la seal mecánica al interior de la clula endotelial, nuestro conocimiento tiene aún muchas lagunas. Se supone que la fuerza de cizallamiento de la membrana se transmite a travs del citoesqueleto al interior de la clula y que esto condiciona una activacin de las protenas G. Sin embargo, cada vez se van descubriendo mecanismos alternativos de transduccin de seal para la activacin de eNOS que son independientes de calcio. Algunos investigadores consideran que la activacin de eNOS por el flujo o el shear stress es completamente independiente del sistema calmodulina-calcio. De hecho, aunque es bien sabido que el shear stress da lugar a incrementos transitorios de calcio intracelular (3), la dinámica de estos incrementos es incompatible con la gnesis continua de NO que produce dicho stress. Una de las rutas alternativas de activacin de eNOS más importantes es la fosforilacin de una serina de la eNOS por una protena kinasa B (tambin conocida como Akt) (Fig. 1). Otras vas de activacin incluyen la fosforilacin de tirosina en la eNOS, el aumento del pH intracelular, y diversas protenas de reciente descubrimiento (4). 

Localizacin intracelular de la eNOS 

            La eNOS está localizada en estructuras membranosas de la clula endotelial como el aparato de Golgi y la membrana plasmática. Las clulas endoteliales poseen pequeas invaginaciones de la membrana, llamadas cavolas, que son contiguas a la superficie de los túbulos sarcoplásmicos. Se piensa que las cavolas son un análogo rudimentario del sistema de túbulos transversos del músculo esqueltico. Estas cavolas son dominios de la membrana plasmática enriquecidos en colesterol y glucoesfingolpidos, pero pobres en fosfolpidos, que funcionan como un lugar estratgico para el procesamiento de mensajeros y la transduccin de seales en la clula endotelial (5). En particular, las cavolas poseen grandes cantidades de protenas G, receptores de IP3, de tirosina kinasa, etc. y además las cavolas están enriquecidas en eNOS y calmodulina. eNOS permanece inactiva mientras está unida a una fosfoprotena de la cavola, la caveolina. Cuando aumenta el calcio intracelular ste se fija a la calmodulina y el complejo calmodulina-calcio se une a eNOS, la desplaza de la caveolina y queda libre para sintetizar NO (5). La eNOS disociada de la caveolina, se transloca al citosol, es decir, deja de formar parte de la fraccin membranosa de la clula para convertirse en una enzima citoslica. Cuando disminuye el calcio intracelular, eNOS vuelve a unirse a la caveolina de la membrana caveolar de forma que eNOS va movindose de la membrana al citosol, y viceversa, dependiendo de la presencia de calmodulina-calcio. Algunos autores han puesto en duda la importancia de la caveolina en la transduccin de seales a la eNOS, especialmente los que defienden que sta no necesita calcio para activarse (4). Sin embargo, se ha aportado una prueba definitiva de la importancia fisiolgica de la caveolina en unos experimentos muy recientes realizados en ratones genticamente carentes de cavolas. Estos ratones presentan una actividad desmedida de la eNOS que se manifiesta por un incremento de la relajacin endotelio-dependiente de vasos aislados, de la liberacin basal de NO y del contenido de cGMP (6). 

Acciones del NO derivado del endotelio 

            El NO producido por la eNOS tiene, como ya se ha comentado, una accin autocrina y paracrina. Ambas se fundamentan en el mismo mecanismo: la unin del NO al grupo hemo de la guanilato ciclasa soluble ocasiona un cambio conformacional que incrementa su actividad (1). Esto condiciona una mayor produccin de GMP cclico (cGMP) a partir de GTP (Fig. 1). El cGMP activa a un enzima fosforilador de protenas, la protena kinasa G (PKG). Resultado de la actividad fosforiladora de esta kinasa son casi todos los efectos biolgicos del NO. Las acciones autocrinas del NO en la clula endotelial han sido las menos estudiadas aunque se sabe que el cGMP disminuye la permeabilidad de la clula endotelial, as como la liberacin del potente vasconstrictor endotelina-1. Las funciones paracrinas del NO se dan fundamentalmente en las clulas musculares lisas subyacentes. Las acciones de la PKG activada por cGMP en la clula muscular lisa van dirigidas a disminuir el calcio intracelular al objeto de producir relajacin de la fibra. Recordemos que la fibra muscular lisa posee un aparato contráctil que depende de calcio para funcionar. En contraste con la clula muscular esqueltica, que utiliza troponina como protena ligadora de calcio, la clula muscular lisa usa calmodulina. El complejo calmodulina-calcio activa a la miosina kinasa, una enzima que fosforila a la cabeza de la miosina tras lo cual sta se une a la actina y la desplaza causando la contraccin (Fig. 1). Los puntos donde se conoce la actuacin de la PKG sobre la dinámica del calcio aparecen en la Fig. 1 y son los siguientes:

1.      Activacin de la ATPasa de calcio y el intercambiador calcio-sodio del retculo sarcoplásmico y de la membrana plasmática.

2.      Inhibicin los canales de calcio tipo L.

3.      Inhibicin de la PLC.

 

 

FIGURA 1. Vas de estimulacin y sntesis de NO en la clula endotelial (arriba) y vas de accin de NO en la clula muscular lisa vascular. G = protena G, PLC = fosfolipasa C, IP3 = inositol trifosfato, IP3R = receptor para IP3, REP = retculo endoplásmico, PKB = proten kinasa B; L-arg = L-arginina, eNOS = oxido ntrico sistasa endotelial, Ca-calm = complejo calcio-calmodulina, L-cit = L-citrulina, sGC = guanilato ciclas soluble, PKG = protena kinasa dependiente de cGMP, RSP = retculo sarcoplásmico, Ca_L= canal de calcio tipo L, K_Ca = canal de potasio calcio-dependiente.

            Otro mecanismo vasodilatador de la PKG, y tambin de forma directa del propio NO, es la activacin de los canales de potasio dependientes de calcio (K_Ca). El aumento de permeabilidad de estos canales hiperpolariza la clula muscular lisa, lo cual disminuye el paso de calcio al citoplasma a travs de los canales de calcio dependientes de voltaje. La disminucin del calcio citoslico disponible relaja a la fibra muscular lisa. 

Papel del NO en el control de la presin sangunea 

            El papel del NO en el control de la presin arterial no pudo establecerse hasta la aparicin de análogos estructurales de L-arginina que pudieran ser utilizados in vivo para inhibir a la NOS. La administracin de este tipo de inhibidores produce una hipertensin intensa y muy duradera. Esta observacin permiti revisar un concepto muy establecido en fisiologa, según el cual, el sistema cardiovascular está sometido a un continuo tono vasoconstrictor debido a la permanente descarga simpática del sistema nervioso. Ahora hay que aadir un segundo tono a los vasos, el tono vasodilatador generado por la permanente liberacin basal de NO desde el endotelio. Los inhibidores de la sntesis de NO no son completamente especficos para ninguna isoforma de la NOS, y mucho menos los utilizados en los inicios de la investigacin del NO. Por ello, la prueba irrefutable del papel del NO endotelial en el mantenimiento de la presin arterial ha sido el empleo de ratones manipulados genticamente que carecen del gen que codifica para la eNOS. Los ratones homocigotos para la delecin del gen son hipertensos (Fig. 2b) (7) y presentan trastornos de la relajacin endotelio-dependiente. Estos ratones, además, son incapaces de compensar las fluctuaciones ocasionales de la presin sangunea dando lugar a trazados de presin errática (Fig. 2b), que recuerdan al trazado clásico de Guyton obtenido en perros a los se desaferentizaron los barorreceptores (Fig. 2a).   

FIGURA 2. a. Registro clásico de la presin arterial en un perro normal (arriba) y del mismo perro (abajo) varias semanas despus de la denervacin de los barorrectores. b. Variabilidad de la presin arterial en ratones normales (arriba) y ratones homocigotos para la delecin de eNOS (abajo). Vase como stos además de una presin arterial muy variable, tienen hipertensin. La lnea blanca es la presin arterial media. Modificado de la cita 7.

Papel del NO en la hipertensin arterial 

            Desde hace muchos aos se sabe que la funcin endotelial está daada en vasos obtenidos de animales hipertensos. Este dao se manifiesta en una mala relajacin de vasos aislados en respuesta a vasodilatadores endotelio-dependientes. Cuando el papel del NO en el control de la presin arterial qued establecido, esto di lugar a numerosos estudios encaminados a dilucidar si la va del NO está alterada en la hipertensin. Dado que los resultados de estos estudios no han sido unánimes, sino que varan dependiendo del modelo de hipertensin usado, vamos a resumir los hallazgos más recientes en este campo en los modelos más utilizados de hipertensin:

Hipertensin gentica de la rata. Es quizá el modelo más utilizado, particularmente la rata espontáneamente hipertensa (SHR) obtenida tras la segregacin y cra durante varias generaciones de ratas con presin anormalmente elevada. Con las ratas que presentan presin arterial normal se realiza la misma operacin para obtener las ratas control (llamada Wistar-Kyoto). La respuesta vasodilatadora endotelio-dependiente de vasos de SHR es claramente defectuosa. Sin embargo, aunque pudiera parecer lo contrario, los estudios acerca de la biologa del NO apuntan a que la actividad y la expresin de la NOS está aumentada en estructuras relacionadas con el control de la presin arterial (vasos, corazn y rin) (2). Esta paradoja se explica porque, aunque la generacin de NO está aumentada en la SHR, sus efectos fisiolgicos están disminuidos por un exceso asociado de anin superxido (8).  

Hipertensin sal-sensible. El modelo más utilizado es la rata Dahl, obtenida tras la segregacin y cra durante varias generaciones de ratas con presin anormalmente elevada tras haber sido sometidas a una dieta alta en sodio (Dahl sal-sensible). Con las ratas que presentan presin arterial normal se realiza la misma operacin y se obtienen ratas Dahl sal-resistente. En este modelo la generacin de NO está claramente disminuida. Parece ser que el defecto está a nivel de la nNOS (no de la eNOS) de la mdula renal, que como es sabido, tiene un papel fundamental en el manejo del sodio. 

Hipertensin renovascular. Se observa un cuadro parecido a la SHR. 

Hipertensin esencial humana. Casi todos los estudios tanto farmacolgicos como analticos indican un defecto de la sntesis de NO. Además, los pacientes normotensos con antecedentes familiares de hipertensin presentan tambin dicha alteracin indicando que el trastorno no es una consecuencia de la hipertensin sino un fallo primario. La mayora de los estudios se han llevado a cabo indirectamente utilizando la tcnica de la medida del flujo sanguneo antebraquial. Estudios más directos realizados en vasos sanguneos obtenidos de biopsias de pacientes hipertensos indican una disminucin de la relajacin mediada por NO. En cuanto al análisis de la produccin basal de NO es particularmente relevante un estudio realizado administrando a hipertensos voluntarios L-arginina marcada radiactivamente y midiendo posteriormente nitrato radiactivo en orina (9). Dado que no existe ninguna va metablica en clulas eucariticas que genere nitrato, excepto la va del NO, las dudas generadas por posible contaminacin por nitratos de la dieta se obvian. Los niveles de nitrato radiactivo urinario son menores en pacientes hipertensos, lo que sugiere una menor produccin global basal de NO en la hipertensin esencial humana. 

Terapia gnica en hipertensin. 

     Se han obtenido resultados bastante espectaculares en ratas SHR y en ratas con hipertensin producida por angiotensina II a las que se les ha realizado una transferencia gnica de eNOS humano (10). La transferencia se lleva a cabo utilizando como vector un plásmido de adenovirus o de citomegalovirus al que se le une el cDNA de eNOS humano. Los experimentos se suelen realizar incubando segmentos vasculares  de la rata hipertensa con el vector vrico, e incluso se ha expuesto el animal vivo al vector administrándolo por va endovenosa. En estos experimentos se ha conseguido disminuir la presin arterial, aumentar la produccin de metabolitos procedentes del NO, aumentar la expresin vascular de eNOS y  mejorar la funcin endotelial. 

Eduardo Nava Hernández

Facultad de Medicina, Universidad de Castilla-La Mancha

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Bibliografa 

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