FISIOLOGÍA. Boletn de la SECF. Vol 5,nº1. Abril 2002

El avance en el conocimiento está ntimamente ligado al avance tecnolgico. El uso de nuevos mtodos sitúa al investigador en una posicin privilegiada para observar nuevos fenmenos, que por su novedad son muy apreciados por la comunidad cientfica. Las pinzas pticas, o el movimiento de partculas con la luz, es un buen ejemplo. En las siguientes lneas Vicente Valero explica las bases de una poderosa herramienta para el bilogo, las pinzas pticas, que permiten mover a voluntad partculas microscpicas con la fuerza de la luz. Su aplicacin en biologa ha permitido medir las fuerzas intermoleculares en clulas.

   

PINZAS PTICAS: APLICACIONES EN BIOLOGÍA

Vicente Valero

INTRODUCCIN

A

 principios del siglo XVII, Johannes Kepler propuso que el “empuje” de las radiaciones solares eran el responsable de la direccin que tomaba la cola de los cometas. En 1873, la teora electromagntica de James Clerk Maxwell demostr tericamente que la luz por s misma poda ejercer fuerzas pticas, denominadas presin de radiacin. Sin embargo, debido al orden de magnitud de estas fuerzas (pN), hubo que esperar hasta 1986 para que Arthur Ashkin describiera experimentalmente el uso del rayo láser para atrapar y manipular pequeas partculas dielctricas (Ashkin y col., 1986) . Un ao despus, demostraron su utilidad en organismos vivos atrapando virus, bacterias y protozoos (Ashkin y Dziedzic, 1987; Ashkin y col., 1987) . Desde entonces, y gracias al desarrollo de esta tcnica, se ha producido una revolucin en la biofsica y bioqumica clásica permitiendo importantes avances en el estudio de motores moleculares, transcripcin de ADN y configuracin estructural de las protenas.

LA FUERZA DE LA LUZ  

Probablemente muchas personas, sin saberlo, hayan tenido la oportunidad de observar el funcionamiento de una trampa ptica en una aplicacin futurista. En un episodio de la pelcula “StarTrek: la prxima generacin”, la nave nodriza sujeta el Enterprise con un rayo luminoso; en esta ocasin, la “ciencia-ficcin” refleja una experiencia real observada en dimensiones microscpicas.

Fig. 1: El rayo que proviene de la nave principal no trata de destruir el Entreprise sino que lo mantiene atrapado. Aunque se pueden dar argumentos para desestimar esta aplicacin, con este ejemplo se trata de ilustrar la forma en que la presin de radiacin luminosa permite atrapar pequeas partculas. La imagen fue adquirida de la página Web de StarTrek.

Cuando sobre una partcula incide un rayo láser de gran intensidad aparecen dos principales fuerzas actuando sobre ella. La más evidente es la fuerza provocada por la dispersin y absorcin de fotones por la partcula. A la segunda, se la denomina fuerza gradiente, proporcional a la polarizabilidad de la partcula y al gradiente de intensidad. En este caso, la fuerza es ejercida en la direccin de más alta intensidad luminosa, hacia donde la partcula es arrastrada. Si ambas fuerzas están equilibradas, se provocará que pequeas partculas queden atrapadas de forma estable. Para conseguir el acentuado gradiente de intensidad, responsable de la trampa y que permite dicha estabilidad, el rayo láser es focalizado en el microscopio a travs de un objetivo de amplia apertura numrica, con el fin de limitar la refraccin en el punto luminoso. As se consigue una elevada intensidad del campo electromagntico en el foco del objetivo y un acentuado decrecimiento de la intensidad en la vecindad.

La partcula, cuando es mayor que la longitud de onda, actúa como una simple lente que refleja y difracta los rayos incidentes. La deflexin de los rayos cambia su momento y, debido a la ley de conservacin del momento, el resultado es una fuerza que mueve la partcula hacia la regin de más alta energa. Una desviacin de la posicin estable del centro de la trampa ptica, provoca una fuerza opuesta que la conduce de nuevo al centro.

Fig. 2: Origen de la fuerza gradiente en rayos pticos. Si la partcula es desplazada del centro de la trampa ptica (A: hacia abajo; B: hacia arriba; C: hacia la derecha), hay una fuerza, dirigida en la direccin de más alta energa luminosa descrita por el perfil Gaussiano del rayo, que la retorna a su posicin de equilibrio. La partcula está atrapada de forma estable si la fuerza gradiente es igual a la fuerza dispersiva.

Para partculas cuyo tamao es del mismo orden de magnitud que la longitud de onda (tal como ocurre en sistemas biolgicos donde el espcimen sujeto de investigacin es del orden de mm y la longitud de onda utilizada es de 1.06 mm), los modelos tericos no pueden predecir las fuerzas actuantes, ya que dependen en gran medida de la forma de la partcula, por lo que hay que realizar los cálculos de forma experimental.

CALIBRACIN Y DETERMINACIN DE LAS FUERZAS

Cmo ya se coment anteriormente, es difcil realizar predicciones tericas sobre la magnitud de las fuerzas pticas, por lo que es preciso calcularlas experimentalmente. En general, es posible medir la respuesta de una partcula atrapada cuando sobre ella actúa una fuerza externa. Por las caractersticas de estas fuerzas, pueden ser consideradas similares a las que ejercen sobre una partcula un fluido viscoso, que obedece a la ley de Stoke. Se asume para pequeos desplazamientos que la partcula se mueve bajo un potencial ptico armnico. As, la fuerza resultante es lineal con el desplazamiento, lo cual significa que la trampa ptica actúa de forma similar a un muelle que obedece a la ley de Hook. La constante o rigidez del muelle, a, es el parámetro que se debe determinar durante la fase de calibracin. De esta forma, slo ha de conocerse la posicin de la partcula atrapada para poder calcular la fuerza que actúa sobre la misma. Uno de los mtodos que permite su determinacin es el de la fuerza de arrastre, el cual  consiste en ejercer una fuerza viscosa sobre la partcula atrapada como consecuencia del flujo de un fluido que puede mover la partcula o hacer que permanezca fija. El desplazamiento, x, desde el centro de la trampa, se debe medir para poder calcular su rigidez, a, que puede calcularse mediante la expresin:  

a = F/x  

            La ley de Stoke permite calcular la fuerza viscosa que actúa sobre una esfera de radio r:  

F = 6phrv 

donde h es la viscosidad del fluido y v su velocidad. La distancia de la partcula atrapada a la base de la camarita debe ser ajustada convenientemente, es suficiente que sea de 5 mm (Simmons y col., 1996) , para evitar la interferencia de fuerzas turbulentas ocasionadas por dicha superficie. La viscosidad del fluido debe ser conocida de forma precisa. Normalmente el movimiento del fluido se provoca moviendo la camarita sobre una plataforma piezoelctrica. 

DESCRIPCIN DEL SISTEMA DE PINZAS PTICAS  

Un sistema de pinzas pticas, consta de dos partes fundamentales. La primera es la pinza ptica propiamente dicha, es decir el láser, el microscopio y la ptica necesaria para guiar el rayo (Block, 1990) . La segunda es el sistema sensor de la posicin de la partcula en la trampa ptica, con una resolucin en la escala de nm (Visscher y col., 1996) .

El láser utilizado suele tener una longitud de onda de 1064 nm, siendo el coeficiente de absorcin relativamente pequeo para este rango espectral (Svoboda y Block , 1994) , lo que resulta idneo para estudiar elementos biolgicos suspendidos en solucin acuosa. De esta forma, el dao inducido por la luz y el calentamiento local se reduce al mnimo.

Hay que tener en cuenta que la fuerza que puede ser ejercida por la trampa ptica es proporcional a la potencia del láser, y que la sensibilidad de la medida de las fuerzas moleculares depende en gran parte de la estabilidad del láser a la salida. Se ha demostrado que el láser es más estable a altas potencias de salida, por encima de los 5 W (Moroz y col., 1997) .

La posicin en tiempo real de una partcula en la trampa ptica, se puede determinar mediante fotodiodos que detectan en cuatro diferentes e independientes áreas el brillo de la imagen de la partcula. La seal de salida es amplificada, se calcula la diferencia de voltaje entre las áreas y se normaliza en funcin de la suma total de los cuadrantes, lo que dará la posicin de la partcula. 

Otro mtodo consiste en el análisis de imágenes. Mediante un algoritmo llamado “centroid tracking” (Gelles y col., 1988) podemos conocer la posicin de una o más partculas simultáneamente, con una precisin del orden de nanmetros, aunque tiene una limitacin en el tiempo, alrededor de 100 Hz, por lo que no puede determinarse la posicin en tiempo real.

MANIPULACIN CON PINZAS PTICAS  

Las fuerzas pticas, aunque son extremadamente dbiles, del orden de decenas de piconewton, pueden atrapar virus, bacterias y protozoos (Ashkin y Dziedzic, 1987; Ashkin y col., 1987) , estudiar el transporte vesicular intracelular (Ashkin y col., 1990) , manipular macromolculas tales como el ADN para estudiar su elasticidad (Chu, 1991) o usarse como escarpelo en microciruga para fusin celular asistida (Steubing y col., 1991) .

Algunos estudios sobre la dinámica de la kinesina evidenciaron la potencialidad de esta tcnica (Svoboda y col., 1993) . Esferas de 0.6 mm de diámetro fueron incubadas con dichas molculas y situadas mediante la trampa ptica sobre un lecho de microtúbulos direccionados. A travs de ellos, y gracias a los motores moleculares, se moveran las microesferas venciendo la oposicin de la fuerza de la trampa. El análisis de los resultados demostr que estos motores biolgicos se movan con regulares pasos de 8 nm de longitud. En similares experimentos, un filamento de actina era sujetado por los extremos a dos microesferas situadas en sendas trampas pticas (Finer y col., 1994) . Dicho filamento se situaba en la vecindad de una microesfera, cubierta previamente con miosina, observándose un desplazamiento de esta última de alrededor de 11 nm, que provocaba un transitorio de fuerzas entre 3 y 4 pN, lo cual resultaba consistente con las predicciones de modelos de contraccin muscular.

En los dos ejemplos anteriores se mostr que la movilidad de molculas individuales puede ser monitorizada sin la complicada presencia de múltiples cinticas, que el progreso del proceso motor puede ser seguido con elevada resolucin espacial y temporal y, por último, que las pinzas pticas permiten el estudio dinámico de las molculas con directa y controlada manipulacin.

Para conocer las propiedades mecánicas de polmeros, as como en la determinacin de la rigidez estructural de componentes celulares, se ha recurrido tambin a las pinzas pticas. Con ellas se ha medido la rigidez de un filamento de actina, que es de ~2×10⁴ pN nm² (Dupuis y col., 1997) o la elasticidad de molculas de ADN (Wang y col., 1997) . Experimentos con Titin, un polipptido filamentoso gigante que se cree esencial en la conservacin de la integridad estructural de la sarcmera, y que desempea un conocido papel en la fuerza pasiva del músculo, revelaron un comportamiento similar al de un muelle no lineal (Kellermayer y col.,1997) . Estirando dicho filamento por sus extremos, unidos a microesferas de latex por medio de una trampa ptica y una micropieta, se comprob que era posible estirarlo con fuerzas entre 20 y 30 pN. Sin embargo la reversibilidad a su longitud inicial ocurra bajo pequeas fuerzas de ~2.5 pN. Escalando estos datos a las dimensiones de la sarcmera, se reproducan muchas de las caractersticas de la fuerza pasiva en relacin con la curva de extensin de las fibras musculares.

Durante la exocitosis, una serie de protenas son responsables de la fusin del grano secretor con la membrana plasmática, as como de los pasos previos que la desencadenan. Sin embargo, quedan muchas cuestiones sin resolver. Trabajos recientes han tratado de caracterizar el anclaje vesicular utilizando como modelo biolgico eosinfilos de caballo para estudiar las fuerzas de interaccin entre dos granos aislados. Tras un protocolo en el que se rompe la membrana celular, los granos son atrapados y puestos en contacto mediante una trampa ptica dual (Valero y col., 2000; Valero y col., 2001) .

Fig. 3: En una trampa ptica dual, el rayo láser es dividido en dos antes de ser canalizado nuevamente en el camino ptico hacia el objetivo del microscopio, que sirve como condensador y es el responsable del gradiente de intensidad y, por lo tanto, de la trampa. La direccin de uno de los rayos es modificada mediante un espejo movible o un deflector acústico ptico. De esta manera se ponen en contacto los granos, de 2 µm de diámetro, y se estudia la fuerza de interaccin entre protenas.

En dichos experimentos, se midieron fuerzas de unin con un rango de valores entre 0-30 pN en los que se pudo romper la unin, lo que manifiesta diferentes constantes de disociacin, estando en concordancia con los diferentes modos de fusin (fusin irreversible, reversible y “Kiss and run”). Es previsible que estudios y modelos similares permitan desvelar cuáles son las protenas esenciales en el anclaje vesicular, cuál es la cintica de dicho proceso y cuáles son las circunstancias que favorecen o inducen la fusin.  

CONCLUSIN 

Las nuevas tcnicas de manipulacin, como la de las pinzas pticas que aqu se ha tratado, han provocado una apasionante revolucin en el estudio de la biologa molecular. Gracias a ellas, se consigue un mayor control experimental y una elevada resolucin temporal y espacial, lo que permite revelar propiedades mecánicas moleculares, as como el comportamiento de molculas en sus funciones primarias.

            Indudablemente, nos encontramos ante un nuevo panorama cientfico en el que la presencia de herramientas pticas, en conjuncin con estudios bioqumicos y estructurales, puede depararnos un futuro prometedor en la búsqueda del conocimiento, permitiendo describir fielmente numerosos sistemas biolgicos que aun hoy siguen siendo un misterio.

Vicente Valero

Department of Applied Physics and Engineering

Cornell University

Ithaca, New York

vv26@cornell.edu

 

Referencias  

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