La mayora de las protenas de membrana ejercen su funcin a travs de cambios conformacionales que transmiten distintas seales entre el interior y el exterior de la clula. Un caso muy interesante es el de los canales inicos, un tipo de protenas de membrana que, en respuesta a seales qumicas o elctricas, permiten el paso de iones a favor de su gradiente electroqumico. Estas protenas participan de forma crucial en procesos tan diversos como la secrecin, la excitabilidad elctrica, la contraccin muscular, la diferenciacin celular o la respuesta inmune, entre muchos otros (Hille, 2001). La clonacin de un gran número de canales inicos, unida a estudios de mutagnesis dirigida en sistemas de expresin heterloga, el desarrollo de la tcnica de patch-clamp para el registro de su actividad y, más recientemente, la descripcin de su estructura tridimensional han permitido avanzar enormemente en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la actividad de estas interesantes protenas. En la actualidad, la complementacin de estas tcnicas con el uso de marcadores fluorescentes unidos a sitios especficos está proporcionando resultados muy interesantes sobre los cambios conformacionales que ocurren en determinados dominios del canal (Bezanilla, 2000). Los registros de corriente elctrica (fl ujo de iones a travs del canal) y de fluorescencia se realizan simultáneamente: el primero proporciona informacin sobre el estado funcional del canal, mientras que el segundo revela las modificaciones estructurales asociadas a dicho estado. Cualquier alteracin estructural de la protena en el entorno del fluorforo puede producir cambios en las caractersticas de ste, como, por ejemplo, su eficiencia cuántica, movilidad, interaccin con fluorforos prximos, etc. La medida de fluorescencia proporciona informacin adicional sobre la redistribucin estructural del canal, ya que permite estudiar estados funcionales no necesariamente asociados al fl ujo de iones a travs del poro, como es el caso de la medida de corrientes mediante patch-clamp.

Los primeros estudios de fluorescencia en canales inicos se centraron fundamentalmente en canales dependientes de voltaje. Las medidas de fluorescencia y los registros de clula entera en clamp de voltaje de dos electrodos se realizaron simultáneamente en oocitos de Xenopus laevis. En estos experimentos, las protenas se marcaron con fluorforos unidos a cistenas (ver más adelante) y los registros de fluorescencia se llevaron a cabo en el polo animal del oocito, donde la fluorescencia basal está significativamente reducida (Mannuzzu et al., 1996). El poder de esta tcnica se vio enormemente reforzado al estudiar cambios en fluorescencia por transferencia resonante de energa (FRET). La eficiencia de FRET es indirectamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre fluorforos, de modo que es un sistema muy sensible para estudiar distancias entre los puntos de la protena donde los fluorforos han sido insertados. As, Bezanilla y cols. pudieron describir a resolucin atmica el movimiento de la cuarta hlice transmembranal (el supuesto sensor de voltaje) del canal de potasio Shaker (Cha and Bezanilla, 1997).

Una desventaja del mtodo descrito previamente reside en la imposibilidad de estudiar regiones del canal en la zona intracelular, donde generalmente residen los dominios implicados en la regulacin del canal por distintos ligandos o protenas reguladoras. Con este objeto, Zagotta y cols. han descrito recientemente una nueva aproximacin en la que los registros de fluorescencia son realizados en un parche de membrana (“patch-fluorometry” o “fluorescencia en parches”; Zheng and Zagotta, 2003). Esta metodologa permite el control del medio intracelular. Al medir únicamente la fluorescencia de un parche escindido de la clula se asegura el registro exclusivo de canales expresados en la membrana plasmática, eliminándose la contribucin de canales en compartimentos intracelulares (cuya actividad no está siendo controlada). Además, no existe contaminacin debida a autofl orescencia procedente de los componentes intracelulares, lo cual mejora la relacin seal-ruido y permite una mayor sensibilidad en la medida. La utilizacin de sistemas de deteccin de fluorescencia convencionales, como cámaras CCD o tubos fotomultiplicadores, permite el registro de fluorescencia en parches conteniendo un número relativamente pequeo de canales.

Nuestro trabajo actual se centra en el estudio de los cambios conformacionales asociados a la funcin del canal inico humano hslo, un canal de potasio sensible a calcio y voltaje. Para ello utilizamos la tcnica de “fluorescencia en parches” descrita por Zagotta y cols. El propsito de este artculo es describir, de un modo general, el equipo, procedimiento experimental y análisis necesarios. Aunque centramos la descripcin en su aplicacin al estudio de canales inicos, tambin se expondrán otras posibles aplicaciones de esta interesante tcnica.

La transferencia resonante de energa es la transmisin no radiativa de energa de un fluorforo donador a un fluorforo aceptor. Para que tenga lugar FRET, deben cumplirse una serie de requisitos fundamentales (para una descripcin exhaustiva, ver Van der Meer, 1994): 1) el espectro de emisin del donador debe solaparse con el espectro de excitacin del aceptor; 2) el donador y el aceptor deben encontrarse a una distancia comprendida entre 10 y 100 Å; 3) el donador debe tener una alta eficiencia cuántica (gran número de fotones emitidos frente al de fotones absorbidos).

En la figura 1 se ilustra esquemáticamente el uso de FRET para el estudio de cambios conformacionales en protenas. Si el donador y el aceptor han sido unidos a dos sitios distintos en la protena de estudio que se encuentran a gran distancia (A), la iluminacin con luz de longitud de onda que excite exclusivamente al donador producirá un espectro de emisin tpico del mismo (B). Si la protena sufre un cambio conformacional que produce un acercamiento de los fluorforos (C), la excitacin del donador producirá fotones que son capaces de excitar al aceptor, y se observará el espectro de emisin de ste junto con una emisin reducida del donador (E).

La cuantificacin de FRET puede hacerse empleando distintos mtodos. Muchos autores utilizan medidas de intensidad de fluorescencia emitida a longitudes de onda puntuales. No obstante, esta aproximacin no elimina las contaminaciones debidas a la emisin del donador o a la excitacin directa del aceptor a las longitudes de onda, e ignora el error debido a variaciones en la eficiencia cuántica del aceptor o en la concentracin total de molculas fluorescentes (Selvin, 1995). Para evitar estos problemas, la solucin ideal es medir espectros de emisin, cuyo análisis permite eliminar los errores mencionados. Existen varios sistemas para la obtencin de espectros, que se describirán más adelante.

Figura 1. Mecanismo de FRET. A, representacin esquemática de una protena marcada con dos fluorforos que forman un par FRET y se encuentran a gran distancia. d, donador; a, aceptor. B, al excitar el donador en ausencia de FRET se obtiene el espectro de emisin del mismo (Em (d)). C, un cambio conformacional podra producir un acercamiento de los fluorforos, dando lugar a FRET D, al excitar el donador en condiciones de FRET se obtiene una combinacin de ambos espectros de emisin (Em(d)+Em(a)).

Previamente a la realizacin de los experimentos de FRET, las protenas deben ser marcadas con los fluorforos. Actualmente existe una gran variedad de marcadores que pueden ser utilizados como parejas de FRET. Algunos de los más utilizados son la 6-tetrametilrodamina (TMRM), de-rivados de maleimidas (como por ejemplo la Alexa Fluo 488 C5 maleimida de Molecular Probes) o derivados de yodo-ace-tamida. Todos ellos tienen en común que reaccionan con el grupo sulfidrilo de las cistenas. Para utilizar estos fluorforos son necesarios los siguientes pasos: 1) eliminar todas las cistenas de la protena de inters; 2) el sitio en el que se de-sea introducir el fluorforo debe mutarse a una cistena; 3) comprobar que dichas mutaciones no afectan a la funcin de la protena; 4) en cada experimento, debe llevarse a cabo la reaccin del fluorforo con la cistena para que el canal quede marcado en el lugar especfico; 5) para evitar el aumento en la seal de fondo debido a la unin inespecfica de fluorforo a otros grupos sulfidrilo presentes en la membrana, es necesario un paso de bloqueo (mediante mutacin u otros reactivos no fluorescentes, como la maleimida de tetraciclina; Gandhi et al., 2000).

Una alternativa a este sistema es el uso de marcadores derivados de la protena verde fluorescente (GFP). Ésta presenta una estructura en forma de barril, con los extremos carboxilo y amino muy prximos, donde un grupo especfico de residuos forma un fluorforo en el interior, que se excita en el rango de 488 nm y presenta un pico de emisin a 502 nm. Mutaciones puntuales de la GFP han dado lugar a diversas variantes de esta protena con distintas propiedades espectrales, que pueden ser usadas como pares de FRET. Uno de los pares más utilizados es el de las variantes azul (CFP) y amarilla (YFP) (que funcionan como donador y aceptor, respectivamente; Tsien, 1998). La secuencia de las protenas fluorescentes puede ser insertada dentro de la secuencia codificante de la protena de inters, dando lugar a una protena de fusin fluorescente con el fluorforo (GFP) insertado en un sitio especfico. Estas protenas de fusin pueden generarse mediante mtodos convencionales de biologa molecular. Por ejemplo, a travs de la introduccin de un sitio de restriccin en la secuencia de la protena objeto de estudio y posterior subclonaje de la protena fluorescente. Alternativamente, las variantes de GFP pueden insertarse de forma aleatoria mediante el uso de un transposn, un mtodo que permite la obtencin rápida de un gran número de protenas de fusin (Sheridan et al., 2002).

Esta última aproximacin ha sido aplicada por nuestro grupo al canal inico hslo, obteniendo con xito una librera de subunidades _ marcadas fluorescentemente, que han sido utilizadas en nuestros experimentos de fluorescencia en parches. Los canales hslo se constituyen en la membrana como homotetrámeros de subunidades _. Nuestro diseo experimental consiste en la formacin de heterotetrámeros formados por subunidades _ marcadas con CFP (donador) y YFP (aceptor) en sitios equivalentes dentro de la secuencia proteica. Las variaciones de FRET son estudiadas junto con la actividad del canal en distintas concentraciones de calcio y a distintos voltajes.

El equipo necesario para este tipo de experimentos consiste en un sistema convencional de patch-clamp sobre un microscopio de fluorescencia, al que se acoplan los componentes necesarios para la obtencin de imágenes espectrales del parche de membrana.

En trminos generales, los componentes del equipo son los siguientes (indicando entre parntesis los componentes concretos del equipo en nuestro laboratorio):

El mtodo mas adecuado de expresin es por inyeccin del mRNA correspondiente a la protena de inters en oocitos de Xenopus laevis. El uso de lneas celulares de mamfero (como HEK293 o CHO) implica una dificultad tcnica adicional, ya que para obtener suficiente seal de fluorescencia el tamao ptimo del parche debe ser 10-15 µm, cercano al tamao de una clula completa.

Las pipetas utilizadas no requieren un tipo de vidrio especial. En nuestro caso, utilizamos capilares comunes tipo Drummond o Kimax. Aunque algunos autores sugieren que el uso de pipetas de cuarzo es más adecuado para evitar contaminacin de la medida por autofl orescencia, en nuestros experimentos no se observ fluorescencia en pipetas que no contenan parches (Zheng and Zagotta, 2003). Las pipetas se fabrican en un estirador, ajustando los parámetros para conseguir aperturas de gran tamao. A continuacin se pulen mediante calor hasta ajustar dicha apertura a 10-15 µm. Estas pipetas, con bordes grandes y redondeados, permiten obtener parches muy estables en oocitos de Xenopus. Éste es un requisito importante, ya que los experimentos implican diversas manipulaciones en el entorno del microscopio (cambio de objetivos, filtros y ajuste del espectrgrafo) que muy probablemente destruiran el parche de membrana al usar otro tipo de pipeta.

La obtencin de parches de membrana se realiza por el mtodo de patch-clamp convencional (Hamill et al., 1981). Con el objetivo 10X se obtiene el sello en el oocito. A continuacin, la pipeta se aleja del mismo lentamente para escindir el parche. Una vez obtenido el parche en la pipeta, el oocito se aleja del campo de visin y el objetivo se cambia al 60X. La altura de la pipeta se ajusta entonces hasta enfocar el parche de membrana, iluminando a la longitud de onda del fluorforo utilizado (488 nm para la YFP; fig. 2A).

Figura 2. A-B Imágenes de la pipeta de patch-clamp. A, luz de excitacin de 488 nm. El parche de membrana, expresando hslo-YFP, se ha sealado con una fl echa. La fluorescencia que rodea la pipeta proviene de restos de membrana adheridos al parche durante los procesos de sellado y excisin. B, campo claro. C-E, espectros correspondientes a parches de membrana expresando combinaciones de subunidades marcadas con protenas fluorescentes. C, homotetrámeros CFP. D, homotetrámeros YFP. E, heterotetrámeros YFP/CFP. F, obtencin de espectros utilizando un microscopio confocal espectral. Izquierda: imágenes correspondientes a un oocito entero de Xenopus expresando hslo-YFP. Cada imagen corresponde a un rango de 4 nm de emisin. Derecha: espectro de emisin de la YFP obtenido a partir de las imágenes de la izquierda. Este mtodo podra ser empleado análogamente con un parche de membrana.

Para obtener el espectro del parche es necesario delimitar el área de luz de emisin, mediante una apertura a la entrada del espectrgrafo, a una franja conteniendo el parche de membrana. En las imágenes recogidas en la cámara CCD, el eje vertical corresponde a la coordenada espacial y el eje horizontal corresponde a las distintas longitudes de onda en las que la emisin ha sido dispersada. El espectro de emisin del parche se obtiene al representar la intensidad de cada pxel a lo largo de la coordenada horizontal, como se representa en la fig. 2C-E. Alternativamente, el espectro se puede obtener mediante un microscopio confocal espectral (fig. 2F).

Figura 3. Análisis experimental. A, lnea continua (“458 nm”), espectro correspondiente a un parche de membrana expresando heterotetrámeros donador/aceptor. Lnea discontinua, espectro del donador. Lnea gruesa, emisin del aceptor. B, La emisin es normalizada frente a la emisin total del aceptor. C, la excitacin directa del aceptor se calcula en parches expresando homotetrámeros hslo-YFP. Las longitudes de onda de excitacin a las que se obtuvo cada espectro se sealan con fl echas sobre el registro. La combinacin de las protenas se representa esquemáticamente en cada gráfica. Crculos grises, YFP. Crculos blancos, CFP.

El espectro de los parches conteniendo heterotetrámeros donador/aceptor (fig. 2E) está compuesto por la emisin del donador (CFP) y la emisin del aceptor, por excitacin directa y por FRET. El análisis experimental requiere la extraccin de los distintos componentes mediante el ajuste de los datos a la funcin más adecuada (en nuestro caso, utilizamos el mtodo de los mnimos cuadrados). La emisin del donador se elimina mediante la sustraccin de un espectro control de CFP (lnea de puntos en fig. 3A), y el resultado (lnea gruesa en fig. 3A) se normaliza respecto al espectro de emisin total del aceptor a la longitud de onda de excitacin del mis-mo (fig. 3B). El componente debido a la excitacin directa del aceptor se obtiene en parches conteniendo canales hslo-YFP (fig. 3C). Nuestros resultados preliminares indican movimientos conformacionales de la estructura del canal dependientes de calcio y voltaje, en distinta medida según el sitio de insercin de los fluorforos (Giráldez, 2004).

Aunque este artculo se ha centrado en la aplicacin de la fluorescencia en parches de membrana al estudio de cambios conformacionales en canales inicos, es importante resaltar la enorme versatilidad que este mtodo presenta. As, puede ser aplicado a otras protenas de membrana, como receptores o transportadores. Por otro lado, la medida de fluorescencia puede realizarse independientemente, y no necesariamente acoplada al registro de patch-clamp. Se ha empleado esta tcnica para estudiar la estequiometra de complejos proteicos en la membrana plasmática (Zheng et al., 2002). Una aplicacin aún más interesante sera el estudio de mecanismos de regulacin. Las protenas reguladoras podran ser marcadas con diversos fluorforos formando par de FRET con el marcador de la protena de inters. El registro simultáneo de funcin y fluorescencia procurará informacin muy importante, espacial y temporal, acerca de los componentes y mecanismos moleculares implicados en la accin de las distintas protenas reguladoras.