ESPECTROSCOPÍA IN VIVO: UN NUEVO MÉTODO PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO Y OTROS PARÁMETROS HEMODINÁMICOS EN TEJIDOS BIOLÓGICOS

José L. González-Mora (a), Felipe A. Martín (b), David Rojas-Díaz (a) y Miguel A. Castellano (b)

El NO es una molécula cada vez mejor conocida que está implicada en la regulación de un amplio espectro de mecanismos fisiológicos y patológicos en el sistema cardiovascular, los sistemas nerviosos central y periférico y en diversas reacciones inmunológicas (para revisiones, Snyder y Bredt, 1992; Moncada y Higgs, 1993). Se sabe muy bien que el NO es una molécula extremadamente reactiva tanto in vitro como in vivo; su vida media ha sido estimada entre unos pocos segundos a algunos minutos (Kelm y Scharader, 1990; Borland, 1991; Beckman et al., 1996; Thomas et al., 2001). No obstante, de acuerdo con su papel como mediador paracrino, este gas puede difundir fácilmente grandes distancias desde las células productoras de NO para alcanzar las células diana (Malinski y Taha, 1992; Fedele y Raiteri, 1999). Durante esta migración paracrina, en particular cuando se genera a altas concentraciones, puede interaccionar en el trayecto con el oxígeno molecular para formar óxidos de nitrógeno (p.e., NO2 y N2O3), reaccionar con otras biomoléculas tales como tioles y aminas o ser hidrolizado a nitritos (NO2-) y a nitratos (NO3-) (Feelisch et al., 1996).
Sin embargo, las reacciones mas importantes se llevan a cabo con las hemoproteínas y especialmente con la hemoglobina (Hb) (Kharitonov et al., 1996), para formar la nitrosilhemoglobina [1] y la MetaHb [2].

Hb(Fe 2+) + NO à Hb(Fe 2+)NO donde Hb(Fe 2+)NO es nitrosilhemoglobina [1]
Hb(Fe 2+)O2 + NO à Hb(Fe 3+) + NO3- donde Hb(Fe 3+) es MetaHb. [2]

La nitrosilhemoglobina [1] tiene una tasa de formación muy lenta (Escrig et al., 1999; Patel, 2000), mientras que la reacción con la OxiHb se realiza muy rápido y con alta eficacia, bajo concentraciones saturantes de oxígeno. Esta reacción es al menos 26 veces más rápida que la autooxidación del NO en soluciones acuosas. Por tanto, los niveles de MetaHb son proporcionales a la concentración de NO y éstos pueden ser usados como un índice indirecto de producción de NO in vitro (Feelisch et al., 1996; Kelm et al., 1997).
El NO a concentraciones muy diluidas no es inherentemente inestable y puede persistir algunos minutos en condiciones aeróbicas, siempre que sea en ausencia de metales. En este sentido, las concentraciones fisiológicas de NO como señal transduccional in vivo son lo suficientemente bajas como para difundir entre la red microcapilar (típicamente unos 100 mm), desde cualquier célula productora de NO hasta las células dianas, sin reaccionar con el oxígeno (Beckman et al., 1996). Sin embargo, una vez que ha alcanzado el interior de cualquier vaso sanguíneo, el NO es rápidamente "eliminado" por la OxiHb para formar MetaHb (ver la reacción [2]) de una forma estequiométrica. En condiciones no patológicas, la concentración normal de MetaHb es menor del 1,5% de la hemoglobina total (Betke et al., 1992).
Esta alta reactividad química del NO hace necesario cuantificar su producción in situ, en el mismo lugar de la fuente de producción, típicamente utilizando microelectrodos. Los métodos electroquímicos son, sin duda, los más comúnmente utilizados; se basan en la oxidación del NO en electrodos sólidos selectivos (Malinski y Taha, 1992; González-Mora et al.,1996; Rodríguez et al., 1996; Méndez et al., 1997; Del Arco et al., 1999; Escrig et al., 1999). No obstante, los microelectrodos voltamétricos o microsensores (Malinski y Taha, 1992) son laboriosos y difíciles de fabricar para su utilización in vivo y frecuentemente tienen problemas de sensibilidad, selectividad o bien de reproducibilidad. Alternativamente, otros autores han publicado métodos de medición de NO basados en técnicas de secuestro de esta molécula con hemoglobina, perfundida a través de una cánula de microdiálisis, como procedimiento válido de cuantificar la producción de NO in vivo. Este procedimiento utiliza una cánula de microdiálisis implantada en el tejido, imitando un vaso microcapilar, perfundido con OxiHb con el objetivo de secuestrar NO procedente del fluido extracelular.
Lo que aquí se presenta es un método alternativo y la idea principal consiste en utilizar la red microcapilar con su OxiHb endógena, en vez de la cánula de microdiálisis perfundida con una solución exógena de OxiHb, como secuestrador de NO y obtener las propiedades espectroscópicas de la Hb mediante fibras ópticas implantadas en el tejido. Para realizar una comparación (y validación) del método utilizaremos los datos obtenidos mediante sistemas ya establecidos como son la voltametría y amperometría usando electrodos de NO selectivos. Ambos métodos han sido utilizados con infusión local, alrededor de la sonda de medida u optodos de fibra óptica, de NO directamente o bien de inhibidores de la NOS. A pesar de que ambos métodos cuantifican, bien directamente el NO en el espacio extracelular o indirectamente el NO desactivado por la Hb (atrapado por su principal secuestrador), la cinética de cambios son completamente superponibles. No obstante, la espectroscopia añade la posibilidad de cuantificar simultáneamente parámetros hemodinámicos tales como la tasa de oxigenación de la Hb y el flujo sanguíneo regional, lo que la hace especialmente atractiva como método de medida in vivo.
Para las medidas de espectroscopía hemos utilizado un equipamiento básico ensamblado en nuestro laboratorio, consistente en una lámpara halógena de iluminación en el rango de 250-800 nm. La luz de esta lámpara es transportada al tejido mediante una fibra óptica de cuarzo de 50 mm de diámetro y 1 m de longitud; otra fibra de similares características se encarga de transportar la luz dispersada en el tejido hasta un detector dotado de una CCD linear (AVS-MC2000; Avantes). Un monocromador miniaturizado forma parte del detector comentado anteriormente. Un ordenador personal comanda tanto el espectrómetro como el sistema de adquisición. Por otro lado, las medidas voltamétricas fueron realizadas con microelectrodos de grafito con electrodeposición de polímero de metaloporfirinas cubiertas de Nafion®. El sistema de registro voltamétrico fue realizado con un analizador bioelectroquímico comercial diseñado en nuestro laboratorio (BECA, ULL, Tenerife).
La OxiHb presenta varias bandas de absorción, una intensa en el ultravioleta (alrededor de 417 nm) conocida como banda de Soret y otras a 542 y 577 nm de menor intensidad (Van Assendelft, 1970, Fairbanks et al., 1992; Feelisch et al., 1996; Kelm et al., 1997). Si a una solución conteniendo OxiHb se le añade NO (ver la ver figura 1 parte A), se puede observar en el espectro absoluto una banda de absorción a 635 nm; esta banda es la correspondiente a la MetaHb, como ha sido sugerido por varios autores tanto in vitro (Feelisch et al., 1996; Kelm et al., 1997) como en estudios in vivo por nuestro grupo (Castellano et al., 2001). La banda de absorción no fue observada después de la conversión de OxiHb a DeoxiHb, indicando que fue causada por la interacción entre el NO y la OxiHb y puede considerarse atribuida a la MetaHb.
Tomando todos estos datos de forma conjunta, estos resultados indican que los cambios en las bandas de absorción con máximos a 577, 593 y 635 nm pueden ser atribuidos a OxiHb, DeoxiHb y MetaHb, respectivamente. Similares conclusiones han sido obtenidas por otros autores (Feelisch et al., 1996; Kohl et al., 2000). De todas maneras, es necesario especificar determinados parámetros particulares (datos sobre la dispersión de los fotones o el camino seguido por éstos), si se desea determinar valores absolutos de absorción o de concentración de estos cromóforos (Delpy et al., 1988; Gratton et al., 1997). Con el objeto de validar si los cambios en la banda de absorción de 635 nm se deben exclusivamente a la MetaHb e indirectamente a los niveles extracelulares de NO, hemos estudiado la respuesta espectrofotométrica de la Hb a las manipulaciones de la concentración basal de NO en el tejido tras: a) inyección local directa de soluciones de NO, muy cerca del sensor espectrofotométrico (optodo); b) estimulación de la producción de NO en el tejido donde se implanta el electrodo y c) inhibición de la síntesis endógena de NO. En otras palabras, utilizando espectroscopía o voltametría con electrodos selectivos al NO, se han modificado los niveles extracelulares de NO en el tejido donde está implantado el optodo fotométrico (espectroscopía) o electrodo selectivo (voltametría). Para incrementar los niveles de NO se estimularon los receptores NMDA por inyección local de un agonista NMDA (ácido quinolínico) y directamente por la inyección del propio NMDA (ver parte C y D de la figura 1). Por otro lado, la producción de NO en el tejido fue reducida por la administración de un inhibidor de la síntesis de diferentes isoformas de la NOS (L-NAME).
Tras 20 minutos de registro de niveles basales, se inyectaron 1,44 nmol de NO (volumen total inyectado 6 ml). Se observó un gran incremento de la banda de absorción a 635 nm (n = 7), así como un incremento de la señal voltamétrica de NO, similares a los obtenido in vitro (ver figura 1 parte A, B). Este efecto puede ser atribuido al incremento de los niveles intravasculares de MetaHb por la interacción del NO con la OxiHb. La administración de agonistas NMDA (50 nmol, n = 9) produjo cambios similares a la administración exógena de NO. La administración de un inhibidor de la NOS (L-NAME, 200 nmol, 6 mm) produjo una disminución estadísticamente significativa de los niveles basales de MetaHb y de NO extracelular (ver figura 1, parte C y D).
Estos datos sugieren que la espectroscopía in vivo puede ser de gran utilidad, no sólo para evaluar parámetros hemodinámicos en tejidos vivos, sino como metodología capaz de estimar la producción de NO e incluso de valorar otros procesos fisiológicos, como metabolismo celular por medio de la valoración del estado redox de citocromos aa3 (602-610 nm) y citocromo c (550 nm) de la cadena respiratoria.
Existe una gran consistencia entre los cambios observados por espectroscopía y voltametría tras la modificación de los niveles basales de NO por inyección local de NO y manipulaciones farmacológicas de éste, lo que permite validar que este método espectroscópico es una herramienta útil para la determinación indirecta de NO en tejidos biológicos, usando la MetaHb presente en la red de microcapilares. Así mismo, se puede asegurar que los niveles de MetaHb son proporcionales a la concentración de NO en la zona de medida, como ha sido ya propuesto para medidas in vitro por otros autores (Feelisch et al., 1996). En resumen, se puede concluir que a la luz de los presentes resultados, la voltametría in vivo con electrodos selectivos de NO y la espectroscopía in vivo son métodos complementarios, que pueden ser utilizados aislada o simultáneamente para determinar la concentración extracelular de NO directa o indirectamente. Sin embargo, la espectroscopía presenta las siguientes ventajas: a) la posibilidad de estimar simultáneamente parámetros hemodinámicos; b) la posibilidad de estudiar el papel que el NO juega en la actividad de los citocromos y consecuentemente la relación existente entre el NO y la tasa de suministro y consumo de oxígeno; c) la espectroscopía in vivo permite la estimación en cualquier tejido, tanto en regiones superficiales (corteza cerebral, piel, etc.) como profundas del sistema nervioso central u otros órganos, con un sensor (dos fibras ópticas) robusto, fácil de limpiar y no reactivo con el tejido donde esta implantado y d) por último, permite monitorizar a tiempo real todos estos parámetros, así como los cambios o alteraciones en el flujo sanguíneo regional, consumo de oxígeno, etc., como índice de actividad neuronal.

Agradecimientos.
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología y la Unión Europea (FEDER 1FD 1997).

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José L. González-Moraa, Felipe A. Martínb, David Rojas-Díaza y Miguel A. Castellanob
aDepartamento de Fisiología y bÁrea de Psicobiología
Universidad de La Laguna.
Tenerife, Islas Canarias, España

La importancia del estrés oxidativo en determinados procesos fisiológicos y fisiopatológicos ha sido demostrada durante los últimos años en multitud de estudios realizados a nivel experimental y clínico. Una prueba del interés de la comunidad científica por el estudio de la participación del estrés oxidativo en la regulación de procesos fisiológicos y patológicos es el hecho de que durante los últimos 5 años se han publicado unos 15.000 artículos sobre estrés oxidativo, a razón de más de 3.000 por año. Sin embargo, uno de los problemas con el que nos encontramos al plantear un trabajo de investigación en el que queremos analizar el estrés oxidativo es elegir la forma más adecuada de determinarlo. En esta breve revisión, los Drs. Sastre y Pallardó presentan de manera resumida las técnicas más usadas para detectar cambios en el grado de estrés oxidativo, y discuten algunas de las ventajas e inconvenientes de las mismas.

DETERMINACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

Juan Sastre Belloch y Federico V. Pallardó Calatayud

Entendemos por estrés oxidativo el desequilibrio entre sustancias oxidantes y antioxidantes a favor de las primeras, bien por un exceso de oxidantes, por un defecto de antioxidantes o por una combinación de ambas situaciones. Las sustancias oxidantes son fundamentalmente especies reactivas del oxígeno (ROS), que se producen de forma fisiológica como consecuencia del metabolismo anaeróbico. Los ROS incluyen radicales libres como el anión superóxido (O2.-), radicales hidroxilo (OH) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), que no es un radical libre. La mayoría de estos radicales libres tienen una vida media muy corta y una gran reactividad, por lo que se combinan con facilidad con el ADN, proteínas, lípidos y glúcidos, produciendo cambios en su estructura y propiedades que, subsecuentemente, pueden dar lugar a daños celulares o incluso sistémicos (Figura 1). Este proceso fisiopatológico puede ser causa o consecuencia en multitud de mecanismos fisiológicos o patológicos.

Presentamos a continuación una clasificación somera de los distintos métodos que pueden utilizarse para la determinación del estrés oxidativo en muestras biológicas. Dividiremos los parámetros de determinación del estrés oxidativo en dos grandes grupos: 1) determinación directa de radicales libres y 2) determinaciones indirectas, que son las más habituales. Estas últimas miden los productos de la reacción de los ROS con las distintas estructuras biológicas, o bien determinan la concentración de pares rédox como los cocientes glutatión oxidado/glutatión reducido (GSSG/GSH) o tiorredoxina oxidada/tiorredoxina reducida.

Determinación directa de radicales libres.
Técnica del "spin trapping".
Como ya hemos comentado, la vida media de los radicales libres es muy corta y su concentración muy baja, por lo que su determinación en muestras biológicas es extremadamente difícil. La técnica más adecuada en estas condiciones es la resonancia paramagnética de electrones (RPE). La técnica de "spin trapping" intenta superar estos problemas mediante la adición de un compuesto diamagnético adecuado, el denominado "trap". Los compuestos diamagnéticos más utilizados son el PBN (N-tert-butil-alfa-fenilnitrona), DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido) o el MNP (2-metil-2-nitrosopropano). Estos compuestos, cuando reaccionan con los ROS, generan radicales nitróxido relativamente estables cuya determinación es bastante reproducible y específica. El mayor problema, especialmente en sistemas biológicos donde están sujetos a degradación por distintos sistemas enzimáticos, es que se acorta su vida media y por lo tanto se dificulta su cuantificación. Esta metodología ha sido aplicada con éxito, por ejemplo, en muestras de hígado crioconservado procedente de biopsias de pacientes con hepatitis vírica. Se observó que el estrés oxidativo en las muestras procedentes de estos pacientes era de varios ordenes de magnitud superior al existente en muestras procedentes de personas sanas.

Técnicas histoquímicas.
La enorme ventaja de estas técnicas es que permiten la determinación del estrés oxidativo "in situ". Esto hace posible obtener información muy valiosa de los lugares de producción de ROS tanto en células como en tejidos.

Visualización de H2O2 y O2-. Estas sustancias pueden ser visualizadas mediante el método de cloruro de cesio y diaminobenzidina-Mn2+, y algunas de ellas pueden ser incluso adaptadas para la detección de especies reactivas mediante microscopía confocal. Este método ha permitido determinar la producción de ROS en la superficie endotelial de vasos cardiacos durante los primeros momentos de la reperfusión tras un periodo de anoxia. También se han utilizado otros métodos, como el de la determinación de ROS mediante el uso de la sustancia fluorescente 2'-7'-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA), la cual tiene la propiedad de incrementar la fluorescencia en presencia de sustancias oxidantes.

Citometría de flujo. El análisis por citometría de flujo utiliza células u orgánulos subcelulares, como por ejemplo mitocondrias aisladas. En este caso, hay que tener en cuenta que el análisis de la actividad oxidativa puede ser complicado por la posibilidad de hallar múltiples formas de O2 reactivo en la misma célula. Además, el óxido nítrico (NO) endógeno puede provocar cambios en las propiedades ópticas en el fluorocromo utilizado, que son iguales a las producidas por otras moléculas que reaccionan con el O2. Agentes bloqueantes e inhibidores de enzimas pueden ayudar a dilucidar la especie responsable del cambio óptico producido en la sonda fluorescente.
El análisis cuantitativo es difícil debido principalmente a tres razones:
1.- La concentración variable de metales, que pueden catalizar o inhibir reacciones de los radicales libres.
2.- La alta concentración intracelular de glutatión, el cual puede formar radicales tiol o sulfinilo o atrapar o reducir especies de O2.
3.- La presencia de otros agentes colectores de radicales libres, como la espermina.
La rodamina, fluoresceína y otros fluorocromos pueden ser químicamente reducidos a formas no fluorescentes. Estos derivados no fluorescentes son fácilmente oxidados por alguna especie del O2 a la forma parental fluorescente. De esta forma, pueden ser utilizados como pruebas fluorogénicas para detectar actividad oxidativa en células y tejidos.
Los compuestos más utilizados en citometría de flujo son el diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH), el dihidroetidio (HE) y la dihidrorhodamina 123 (DRh123).

2) Determinaciones indirectas.
Hay dos subtipos de determinaciones indirectas del estrés oxidativo: las que se realizan sobre productos resultantes de la combinación de ROS con otras biomoléculas y las basadas en el estado rédox de los sistemas antioxidantes.
El primer apartado es, con diferencia, el más amplio y complejo de todos, pues incluye una gran cantidad de posibles parámetros de medida. Traemos aquí a colación tan solo aquellos que tienen una mayor repercusión en la bibliografía.

Lípidos.
La formación de dienos conjugados es una de las consecuencias del ataque oxidativo a los lípidos poliinsaturados (PUFAS). El método convencional para su determinación consiste en su extracción de las muestras biológicas con una mezcla de cloroformo-metanol y midiendo su absorbancia a 233 nm. El método puede utilizarse tanto "in vivo" como "in vitro" porque es relativamente rápido y simple. Se han realizado trabajos en muestras humanas de bilis y jugo duodenal en pacientes con pancreatitis o cáncer de páncreas, en plasma de pacientes con distintas patologías, etc.
La determinación de peróxidos lipídicos es, posiblemente, una de los marcadores más conspicuos dentro del campo del estrés oxidativo. Dentro de este grupo de sustancias, con diferencia, el malondialdehido (MDA) es el lipoperóxido más estudiado. Existen distintas formas de determinarlo. En la actualidad se considera que la determinación de MDA mediante la técnica espectrofotométrica de TBARS (thiobarbituric reactive substances) es poco fiable, sobretodo en plasma. Se recomienda el uso de métodos basados en el uso de sistemas HPLC con detección con ultravioleta.

Proteínas.
La oxidación de las proteínas es un parámetro muy fiable que puede utilizarse en muestras biológicas tanto "in vivo" como "in vitro". Existen multitud de situaciones tanto fisiológicas como patológicas donde se producen modificaciones oxidativas de las proteínas. El grado de estas modificaciones puede ser valorado mediante la determinación del contenido de carbonilos en las proteínas. En realidad, la oxidación de las proteínas puede producirse mediante procesos que oxidan y rompen la unión peptídica y aquellos procesos que modifican cadenas laterales, como por ejemplo por reducción de azúcares y lípidos asociados a las proteínas, que generan productos como la pentosidina o el 4-hidroxi-2-nonenal. El método más utilizado y reproducible para valorar el contenido de carbonilos en una muestra se basa en la reacción de éstos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina para formar 2,4-dinitrofenilhidrazona, la cual puede ser detectada y cuantificada espectrofotométricamente o por inmunoquímica mediante enzimoinmunoensayo o western blotting.

Ácidos nucleicos.
Una de las causas más importantes de daño al ADN es el ataque oxidativo, el cual da lugar a la hidroxilación del ADN. Algunos de los productos de oxidación del ADN pueden encontrarse en orina, sangre u otros fluidos. Los parámetros más utilizados son timidina glicol y 8-hidroxi-2'-deoxiguanina. La segunda es con diferencia la más utilizada. Sin embargo y pese a la abundante bibliografía al respecto, no existe un consenso sobre el protocolo, ni siquiera sobre la mejor técnica para su determinación. Existen distintos métodos en la bibliografía y cada uno de ellos ofrece ventajas e inconvenientes evidentes. Se puede determinar mediante HPLC con detección electroquímica, cromatografía de gases, mediante HPLC/masas o mediante "comet assay" (electroforesis de ADN oxidado)

Detección de óxido nítrico.
EL NO es un radical libre y existen multitud de técnicas para su detección. Entre ellas se incluyen aquellas que utilizan el metabolismo de la L-3H-arginina, la quimioluminiscencia de NO al reaccionar con el ozono, o sondas fluorescentes como la 4,5-diaminofluoresceina (DAF2-DA) y DCFH, "spin traps" como el N-(ditiocarbonil)-N-metil-D-glutamina (MGD) y el reactivo de Griess. Con la excepción de DAF2-DA y MGD, todos los demás detectan productos de degradación del NO como son nitritos, nitratos y peroxinitritos. La utilización del reactivo de Griess es normalmente la técnica de elección por su sensibilidad y reproducibilidad.

Glutatión.
El cociente GSSG/GSH es uno de los mejores marcadores del estado rédox tanto celular como orgánico. Sin embargo, su determinación ofrece una serie de problemas. Varios son los métodos que se utilizan para la determinación del mencionado cociente. La determinación exacta depende fundamentalmente de la prevención de la autooxidación del GSH durante el procesado de las muestras. El disulfuro formado (GSSG) está presente en cantidades mínimas con respecto a la forma oxidada, de forma que la oxidación de una pequeña cantidad de GSH puede dar lugar a un enorme error en los niveles de GSSG. Para prevenir la autooxidación del GSH se utilizan una serie de sustancias entre las que destacan la N-etilmaleimida (NEM9), la 2-vinil piridina (2-VP) o el ácido iodoacético (IAA). Entre todos el NEM es el preferido, debido a su rápida velocidad de reacción y a que la alquilación del GSH tiene lugar a 4ºC y en medio ácido. Normalmente, lo ideal es determinar el GSH por alguno de los métodos habituales como el método de Reed (HPLC) o los de Tietze (enzimáticamente), o determinando el GSH mediante la enzima glutatión S-transferasa. En nuestro laboratorio describimos un método (Asensi et al.) para la determinación del GSSG con una muy baja autooxidación del GSH, mediante el uso de NEM como agente quelante y determinación por HPLC/UV del GSSG. El método de Reed mide el glutatión total, de forma que se debe sustraer de esta cantidad la determinación de GSSG para obtener los valores del cociente GSSG/GSH. Es importante tener en cuenta que la mera disminución de la concentración de GSH no implica necesariamente una situación de estrés oxidativo. Es el incremento en el cociente el que denota un estado de estrés oxidativo. La versatilidad del cociente GSSG/GSH ha permitido caracterizar situaciones prooxidantes tanto en células y en mitocondrias aisladas como en hepatocitos aislados, células en cultivo y también en sangre total de animales o eres humanos. En la apoptosis, células neoplásicas en el ejercicio físico, el envejecimiento o la diabetes han sido descritos aumentos del cociente GSSG/GSH.

Capacidad antioxidante total.
Esté parámetro permite determinar la acción acumulada antioxidante de todos los antioxidantes presentes en el plasma o en algún fluido corporal. Aporta, por tanto, un parámetro integrado más que la simple suma de la actividad de las distintas sustancias antioxidantes presentes en una muestra biológica. Por ello, no es una medida directa del estrés oxidativo, pero sí permite tener una idea bastante aproximada de las condiciones en las que nos estamos moviendo. Esto es particularmente útil en muestras de seres humanos, ya que el procesamiento de las muestras, habitualmente plasma, es muy sencillo. El método original se centra en el análisis TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter) propuesto por Wayner et al. en 1985. El método se basa en la propiedad de algunas sustancias como ABAP o AAPH de descomponerse produciendo un flujo de radicales peroxilo a una velocidad constante y dependiente de temperatura. Estos radicales peroxilo inician una cadena de lipoperoxidaciones. El método tiene algunos problemas, como el de ser muy sensible a la temperatura o cambios de pH. Las condiciones de almacenamiento de las muestras son también importantes debido a la labilidad de algunos antioxidantes. Se recomienda su análisis inmediato y cuando esto no es posible, la rápida obtención del plasma en el caso de muestras sanguíneas, su almacenamiento a -80ºC y su determinación en los tres días siguientes. La concentración de proteínas o ácido úrico, debido a su alto poder antioxidante, debe ser tenida en cuenta a la hora de exponer los resultados.

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Juan Sastre Belloch y Federico V. Pallardó Calatayud*
*Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina
Universidad de Valencia.
Av. Blasco Ibañez 17
46010 Valencia
Federico.V.Pallardo@uv.es